前言
腫瘤的個體化治療基因檢測已在臨床廣泛應用，實現腫瘤個體化用藥基因檢測標準化和規范化，是一項意義重大的緊迫任務。本指南從診斷項目的科學性、醫學實驗室檢測方法的準入、樣本采集至檢測報告發出的檢測流程、實驗室質量保證體系四個方面展開了相關論述，使臨床醫生能夠了解所開展檢測項目的臨床目的、理解檢測結果的臨床意義及對治療的作用;醫學實驗室為患者或臨床醫護人員提供及時、準確的檢驗報告，并為其提供與報告相關的咨詢服務。檢測技術的標準化和實驗室準入及質量保證對臨床和醫學實驗室提出了具體的要求，以最大程度的保證檢測結果的準確性。
本指南是參考現行相關的法規和標準以及當前認知水平下制定的，隨著法規和標準的不斷完善，以及腫瘤個體化治療靶點基因的不斷發現，本技術規范相關內容也將進行適時調整。
本指南起草單位：中國醫學科學院腫瘤醫院分子腫瘤學國家重點實驗室、蘇州生物醫藥創新中心，經國家衛生計生委個體化醫學檢測技術專家委員會、中國抗癌協會相關專業委員會、中華醫學會檢驗醫學分會、中華醫學會腫瘤學分會的專家修訂。
本指南起草人：詹啟敏、曾益新、王玨、姬云、錢海利、李曉燕、孫石磊
目 錄
1. 本指南使用范圍 1
2. 簡介 1
3. 標準術語和基因突變命名 1
3.1標準術語 1
3.2 基因突變命名 2
3.3 參考序列 2
3.4 各類變異 2
4. 分析前質量保證 5
4.1 樣本類型及獲取 5
4.2 采樣質量的評價 6
4.3 樣本采集中的防污染 6
4.4 樣本運送和保存 6
5.分析中質量保證 7
5.1 實驗室設計要求 7
5.2 檢測方法 7
5.3 DNA提取方法與質量控制 13
5.4 RNA提取方法與質量控制 14
5.5 試劑的選擇、儲存及使用注意事項 14
5.6 核酸擴增質量控制 15
5.7 設備維護和校準 15
5.8 人員培訓 15
5.9 方法的性能驗證 16
6. 分析后質量保證 17
6.1 檢測結果的記錄 17
6.2 失控結果的記錄與分析 17
6.3 報告及解釋 18
6.4 記錄保留 18
6.5 檢測后基因咨詢 18
6.6 樣本(及核酸)保留與處理 18
6.7 檢測與臨床數據收集與分析 19
7. 腫瘤個體化醫學檢測的質量保證 19
7.1 標準操作程序 19
7.2 質控品 19
7.3 室內質量控制 20
7.4 室間質量評價 21
7.5 PCR污染控制 21
附錄A：常見的檢測項目 22
A.1 基因突變檢測項目 22
A.2 基因表達檢測項目 30
A.3融合基因檢測項目 33
A.4 基因甲基化檢測項目 34
參考文獻： 37
1. 本指南使用范圍
本指南由國家衛生計生委個體化醫學檢測技術專家委員會制定，是國家衛生計生委個體化醫學檢測指南的重要內容，旨在為臨床分子檢測實驗室進行腫瘤個體化用藥基因的檢測提供指導。本指南的主要適用對象為開展個體化醫學分子檢測的醫療機構臨床分子檢測實驗室。
2. 簡介
腫瘤個體化治療以疾病靶點基因診斷信息為基礎，以循證醫學研究結果為依據，為患者提供接受正確治療方案的依據，已經成為現代醫學發展的趨勢。臨床研究證實，通過檢測腫瘤患者生物樣本中生物標志物的基因突變、基因SNP分型、基因及其蛋白表達狀態來預測藥物療效和評價預后，指導臨床個體化治療，能夠提高療效，減輕不良反應，促進醫療資源的合理利用。
3. 標準術語和基因突變命名
3.1標準術語
1)基因(Gene):是遺傳物質的最小功能單位，是指具有一定生物學意義的一段DNA。
2)突變(Mutation)：是細胞中DNA核苷酸序列發生了穩定的改變。
3)融合基因(Fusion gene)：是指兩個基因的全部或一部分的序列相互融合為一個新的基因的過程。融合基因的表達產物為融合蛋白。
4)基因表達(Gene Expression)：是基因中的DNA序列生產出蛋白質的過程。步驟從DNA轉錄成mRNA開始，一直到對于蛋白質進行翻譯后修飾為止。
5)基因擴增(gene amplification)：為一特異蛋白質編碼的基因的拷貝數選擇性地增加而其他基因并未按比例增加的過程。
6)DNA甲基化(DNA Methylation)：為DNA化學修飾的一種形式，將甲基添加到DNA分子上，例如在胞嘧啶環的5'碳上。DNA甲基化能在不改變DNA序列的前提下，將DNA甲基化狀態遺傳至下一代細胞或個體。
7)聚合酶鏈反應(PCR)：是一種體外擴增特異DNA片段的技術。利用DNA在體外攝氏高溫時變性會變成單鏈，低溫時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。
8)質控品：是含量或成分已知的處于與實際樣本相同的基質中的特性明確的物質，這種物質通常與其他雜質混在一起，專門用于質量控制目的的樣本或溶液。
3.2 基因突變命名
人類基因組突變學會(HGVS)已建立系統的基因突變命名方法。具體基因突變命名方法可查閱網站http://www.hgvs.org/mutnomen/index.html。HGVS基因突變命名指南根據需求不斷更新。本文以2011年8月更新版本為準。
當描述某一序列改變時，其前綴表明其參考序列類型。例如“g.”表示基因組序列，“c.”表示cDNA序列，“m.”表示線粒體DNA序列，“r.”表示RNA序列，“p.”表示蛋白序列。在數據庫中的收錄號以及版本號應當在實驗記錄報告中列出，當兩種突變在反式(in trans)中檢測到，則用方括號表示。例如，CF突變為雜合性突變(508號苯丙氨酸缺失和1303號天冬酰胺被賴氨酸替代)，則在DNA水平規范描述方式為c.[1521_1523delCTT]+[3909C>G]。
3.3 參考序列
美國國立生物技術信息中心(NCBI)收錄的參考序列編碼具有權威性及唯一性。其中前綴“NM_”表示為mRNA序列，“NP_”表示多肽序列，“NG_”表示基因組序列。基因組參考序列應列出完整基因序列，包括5'以及3'非編碼區(UTR)。當使用某段編碼DNA參考序列描述突變時，應選擇合適的轉錄體，且轉錄體的起始轉錄點應當明確，例如選擇最常見的轉錄體，或者是已知的最大轉錄體，或者具有組織特異性的編輯轉錄體。當某一參考序列具有多種轉錄方式時，選擇NCBI數據庫里注釋最全面的版本。
3.4 各類變異
3.4.1 DNA序列變異術語規范
DNA核苷酸用大寫字母A(腺嘌呤)、C(胞嘧啶)、G(鳥嘌呤)以及T(胸腺嘧啶)來表示。用正鏈來表示DNA序列。當DNA序列改變時，以相應核苷酸所在位置及相應字母來描述。“>”符號表示“從某一變化至另一”。在描述突變方式時，數字、字母、箭頭、上標以及下標之間不應出現空格。
3.4.2 RNA序列變異術語規范
RNA序列以小寫字母a(腺嘌呤)、c(胞嘧啶)、g(鳥嘌呤)、u(尿嘧啶)進行描述。RNA序列改變描述方式與DNA相類似。具體術語可參閱HGVS網站(http://www.hgvs.org/mutnomen/index.html)。
3.4.3蛋白質序列變異術語規范
蛋白質序列改變通常以單個字母或三個字母(第一個字母大寫)來描述。盡管單個字母描述氨基酸明確無誤，但是由于三聯密碼子相對于其編碼的氨基酸存在冗余性，具體給出發生突變的三聯體密碼子可以更清楚地描述氨基酸改變方式。例如，用來描述氨基酸的A(丙氨酸)、C(半胱氨酸)、G(甘氨酸)以及T(蘇氨酸)可能會與核苷酸字母A(腺嘌呤)、C(胞嘧啶)、G(鳥嘌呤)以及T(胸腺嘧啶)相混淆。
3.4.4錯義突變及無義變異術語規范
由于三聯體密碼子的簡并性，多個位點核苷酸的改變可能不影響最終氨基酸序列。因此，應該分別從DNA水平和氨基酸水平描述突變。從DNA水平對某一突變位點的描述方式包括堿基位點，正常堿基，“>”符號，突變堿基。例如，某一蛋白第551號氨基酸殘基由G(甘氨酸)突變為D(天冬氨酸)，從DNA水平描述即c.1652G>A。
在氨基酸水平，由于錯義突變的產物以氨基酸殘基位點以及表示氨基酸的單字母或三聯體密碼子來描述。表示方法是野生型的氨基酸、位點、突變氨基酸，三者之間不要有空格。例如，p.Gly551Asp表示該蛋白中551號甘氨酸殘基(G)被天冬氨酸殘基(D)所代替。無義突變表示方法與之相類似。需要指出的是“X”符號代表終止密碼子。例如，p.Gly542X表示542位點的甘氨酸殘基被終止密碼子所代替。
3.4.5 缺失和插入術語規范
缺失和插入突變分別用前綴“del”和“ins”來表示，并注明突變位點以及堿基。例如，c.441delA表示在該DNA序列中441號位點發生A堿基缺失。c.241_243delATC表示在該DNA序列中從241號到243號缺失ATC三個堿基。
在蛋白水平，上述突變描述方式為p.Ile24del，表示該蛋白質中第24號的異亮氨酸殘基發生缺失。“indels”則表示該段序列缺失的同時有片段插入。例如，234_239delAATTCGinsTA(或者234_239delinsTA)表示該DNA序列234至239號位點缺失AATTCG六個堿基，同時該段位點被新插入的TA堿基所替代。
3.4.6 移碼突變術語規范
移碼突變用“fs”符號來表示。“fs*#”則用于進一步描述突變類型。例如，p.His62Profs*21表示該蛋白發生移碼突變，第62號氨基酸由組氨酸突變為脯氨酸并產生新的閱讀框架，終止于第62號密碼子下游21號密碼子處。該突變也可簡要描述為p.His62fs，即該蛋白從第62號密碼子發生移碼突變。
3.4.7 堿基重復序列
HGVS推薦，核苷酸重復序列基因多態性描述時通常以一個重復序列為單元，后面加上“[重復的次數]”，如CGG[55]。當重復序列的次數在一個范圍之內時，需要在小括號“()”中標注出可能的最少的和最高的重復次數，如某個人HTT基因中發現有12個和15個CAG重復，基因水平的表示如下：c.52CAG[12]+[15]，蛋白水平則表示為：p.Gln18[12]+[15]。HTT基因的重復序列范圍則描述為：c.52CAG(27_35) 或 p.Gln18(27_35)。
3.4.8 遺傳藥理學基因型術語規范
最廣泛使用的命名法描述遺傳藥理學基因型不同于其他遺傳學基因檢測，例如代謝相關基因細胞色素p450家族，人類細胞色素P450(CYP)等位基因命名委員會(http://www.cypalleles.ki.se)推薦用“*”命名，見圖1。在該系統中，最常見的等位基因被指定為“* 1”。
3.4.9 其他
對于更復雜的突變，可參考HGVS(http://www.hgvs.org/mutnomen)建議的命名規則，解決其他復雜的變異的命名。
4. 分析前質量保證
4.1 樣本類型及獲取
4.1.1 新鮮組織(包括手術和活檢組織)
腫瘤新鮮冷凍材料可提取出最高品質的DNA、RNA。在手術現場取樣的情況也比較多，但需要在顯微鏡下確認腫瘤細胞含量。周圍炎癥嚴重的腫瘤、黏液產生過高的腫瘤、病變中心廣泛纖維化的腫瘤細胞不能采集，以免產生假陰性結果。切割后取其中一半，并利用另一半切面制作組織標本，然后進行確認。
手術切除的組織樣本理想的保存方法是迅速置于液氮中，然后保存于液氮罐或-80℃冰箱，這一過程應在手術樣本離體后30分鐘內完成。由于組織樣本通常需先進行病理學分析，在分析完成后應盡早將組織樣本置于穩定劑中，避免核酸降解。
4.1.2 石蠟包埋組織(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)
10%中性福爾馬林固定手術切除樣本，按病理學操作規范進行取材。
制作石蠟切片時，切取5片連續切片，其中1片進行HE染色，確認腫瘤細胞的含量。在高靈敏度檢測方法中，可考慮使用活檢標本。
DNA容易受固定的影響，長時間(1周以上)浸泡在福爾馬林中的樣本的DNA會被片段化，不能檢出突變。活檢材料的固定時間一般是24小時，對于穿刺等活檢樣本，固定時間控制在6~24小時為佳。
4.1.3胸腹水等細胞學樣本
用胸腹水中的腫瘤細胞用于基因檢測時，必須確認腫瘤細胞，穿刺獲得胸腹水樣本提交給細胞病理檢查之后，剩余液體冷藏/冷凍保存，也可在含有細胞成分的離心沉淀中加入含有蛋白質變性劑的緩沖液(AL緩沖液，Qiagen公司)等室溫保存。由于細胞學樣本的腫瘤細胞含量較低，因此必須使用高靈敏度檢測方法。
4.1.4 血漿樣本
循環DNA(circulating free DNA，cfDNA)是存在于血漿中的游離DNA，腫瘤來源的DNA占血漿游離DNA的比例在不同腫瘤及病例中相差懸殊(0.01~93%)，從而限制了外周血在腫瘤分子檢測時的應用。目前已有多篇文獻證實可利用從血漿游離DNA檢出突變，但需要使用ARMS法等靈敏度非常高的檢測方法。
采集外周血提取血漿游離DNA進行檢測，取樣時應使用一次性密閉EDTA抗凝真空采血管，采集6~10ml全血，冷藏運輸，6小時內分離血漿，提取游離DNA，保存到-80℃冰箱中，并避免反復凍融。如外周血需長時間運輸，建議用商品化的游離DNA樣本保存管，在常溫條件下，cfDNA在全血中可穩定保存7天。
4.2 采樣質量的評價
腫瘤細胞是否存在，是開展腫瘤個體化治療基因檢測的重要前提。如果要確認腫瘤細胞存在，與病理診斷醫生密切合作是非常必要的。
采樣評價內容包括：細胞組成、腫瘤細胞的數量，是否按照要求進行處理與運輸。評價方法包括肉眼觀察、顯微鏡下觀察和濃度分析等。
腫瘤組織切片等應經病理醫師審閱，取一張切片HE染色后顯微鏡下觀察，確保腫瘤細胞存在，并記錄腫瘤組織含量，標注腫瘤細胞密集區域。
4.3 樣本采集中的防污染
樣本采集最好采用一次性材料，不用處理便可直接使用;
制備不同患者病理切片樣本時，需更換新刀片，并清除操作器皿上先前樣本的殘留;
采集中要特別注意防止污染，防止混入操作者的毛發、表皮細胞、痰液等;
如使用玻璃器皿，必須經高壓滅菌，以使可能存在的DNase失活;
如提取RNA樣品，必須采用RNase抑制劑措施和無RNase材料。
4.4 樣本運送和保存
原則上按照《個體化醫學檢測質量保證指南》要求進行。
實驗室應建立詳細的樣本運送標準操作規程(SOP)，對臨床醫生提供樣本采集手冊，要求物流人員填寫相關運送記錄表，確保運送過程中樣本的安全性和過程的可控性。
需要轉送的樣本：用于RNA檢測的樣本，如果未經穩定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運送。
經過適當穩定化處理的樣本可在常溫下運送，如用于DNA擴增檢測的EDTA抗凝全血樣本及用于RNA擴增檢測的經穩定化處理的樣本。
5.分析中質量保證
5.1 實驗室設計要求
原則上按照《個體化醫學檢測質量保證指南》要求進行。在符合國家衛生計生委要求的個體化醫學檢測實驗室和通過審核驗收的臨床基因擴增檢驗實驗室完成。
5.2 檢測方法
5.2.1 Sanger測序法
5.2.1.1技術原理
Sanger測序法即雙脫氧鏈終止法(Chain Termination Method)，利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。
5.2.1.2技術特點
該方法是DNA序列分析的經典方法，最直接的、可檢測已知和未知突變的一種方法。由于該方法可直接讀取DNA的序列，因此被認為是基因分型的金標準。
主要優點：測序長度較長，可發現新的變異位點，包括一些新的少見的突變形式及突變的確切類型，如點突變、片段缺失。
局限性：靈敏度不高，突變等位基因需要超過20%才能檢出。對樣本中腫瘤細胞的含量和比例要求較高，一般要求腫瘤細胞含量不低于50%，如果腫瘤細胞比例低于50%，則假陰性出現的概率會顯著增加;不適用于活檢或細胞學樣本。
5.2.2焦磷酸測序法(Pyrosequencing)
5.2.2.1技術原理
焦磷酸測序技術是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應。當測序引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶等4種不同酶的協同作用下，將引物上每一個dNTP聚合時釋放的焦磷酸基團(PPi)與一次熒光信號的釋放偶聯起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列和定量分析序列變化的目的。
5.2.2.2技術特點
焦磷酸測序技術是一種新型的酶聯級聯測序技術，其重復性和精確性可與Sanger測序相媲美，而測序速度則大大提高，非常適合對已知的短序列進行重測序分析。
主要優點：檢測靈敏度為10%，相對Sanger測序法高，對體細胞突變和甲基化等可實現定量檢測;分型準確可靠，通量較高，實驗設計靈活，可發現新的突變或遺傳變異。
局限性：測序長度較短，不能對長片段進行分析。檢測靈敏度中等，難以檢出低于10%的突變。不適用于活檢或細胞學樣本。
5.2.3新一代測序 (next generation sequencing，NGS)
5.2.3.1技術原理
NGS又稱大規模平行測序(MPS)，包含多種可以一次性產生大量數字化基因序列的測序技術，是繼Sanger測序的革命性進步，采用平行測序的理念，能夠同時對上百萬甚至數十億個DNA分子進行測序，實現了大規模、高通量測序的目標。不同廠家的產品測序原理不同，主要分為邊合成邊測序(Sequencing by synthesis，SBS)、基于“DNA簇”和“可逆性末端終結(Reversible Terminator)大規模平行測序、 4色熒光標記寡核苷酸的連續連接反應測序和半導體芯片測序。
5.2.3.2技術特點
高通量測序技術不僅可以進行大規模基因組測序，還可用于基因表達分析、非編碼小分子RNA的鑒定、轉錄因子靶基因的篩選和DNA甲基化等相關研究。
主要優點：高通量測序技術有三大優點是傳統Sanger測序法所不具備的。第一，它利用芯片進行測序，可以在數百萬個點上同時閱讀測序。第二，高通量測序技術有定量功能，樣品中DNA被測序的次數反映了樣品中這種DNA的豐度。第三、利用傳統Sanger測序法完成的人類基因組計劃總計耗資27億美元，而現在利用高通量測序技術進行人類基因組測序，測序成本只需1千美金。
局限性：檢測靈敏度和測序深度相關，一般來說，NGS在腫瘤體細胞突變檢測時，檢測靈敏度為10%;已知的與腫瘤相關驅動基因數量有限，疾病表型和基因型的關系還有賴于生物信息的解讀，目前NGS應用于腫瘤細胞突變檢測的標準化和質量控制尚未形成共識。
5.2.4擴增阻滯突變系統 (ARMS)-PCR法
5.2.4.1技術原理
擴增阻礙突變系統(amplification refractory mutation system, ARMS)是PCR技術應用的發展，也稱等位基因特性PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)等，用于對已知突變基因進行檢測。該法通過設計兩個5`端引物，一個與正常DNA互補，一個與突變DNA互補，對于純合性突變，分別加入這兩種引物及3`端引物進行兩個平行PCR，只有與突變DNA完互補的引物才可延伸并得到PCR擴增產物。如果錯配位于引物的3`端則導致PCR不能延伸。
5.2.4.2技術特點
ARMS-PCR是目前實驗室常用的基因突變檢測方法。
主要優點：ARMS-PCR法檢測靈敏度高，可檢測腫瘤細胞中突變比例為1%甚至更低的突變基因。
局限性：只能檢測已知的突變類型，不能發現一些新的、未知的突變;如果檢測的突變位點或類型較多，則隨著引物數目增加出現非特異性結合的概率也相應增加;當檢測位點較多時，對DNA樣本量的需求增加。
5.2.5 高分辨率熔解曲線(HRM)法
5.2.5.1技術原理
高分辨率熔解曲線(high-resolution melting，HRM)是一種基于PCR新型技術，用于檢測基因變異包括未知的基因變異、單核苷酸多態性以及基因甲基化。HRM是基于在加熱過程中雙鏈變性為單鏈的原則。DNA雙鏈體的熔解溫度差異反應了基因的變異。雙鏈DNA片段在其特定的溫度熔解，熔解的溫度由片段的CG含量、序列組成、長度以及一個和多個雜合堿基決定。用DNA嵌合的染料可以看到任何雙鏈片段的熔解峰圖，在有熒光嵌合染料的情況下PCR擴增片段，擴增后的產物通過一個快速的可控的加熱處理開始熔解。熒光水平在升溫的過程中實時監測，染料隨著雙鏈DNA的熔解，熒光信號逐漸減少。
5.2.5.2技術特點
由于HRM分析不受堿基突變位點和種類的限制，可用于突變掃描、基因分型、序列匹配、DNA甲基化等方面的研究。
主要優點：檢測靈敏度1%，特異性高，重復性好;封閉體系，減少污染的可能性;擴增和檢測同時進行，無需PCR后進行處理。
局限性：通過熔解曲線的圖不能判斷某一特異性的變異體，下游分析中檢測需要有測序等補充。
5.2.6 數字PCR(Digital PCR)
5.2.6.1技術原理
數字PCR是一種核酸分子絕對定量技術。相較于qPCR，數字PCR能夠直接數出DNA分子的個數，對起始樣品絕對定量。通過將一個樣本分成幾萬到幾百萬份，分配到不同的反應單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA 模板) ，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR 擴增，擴增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統計學分析。數字PCR技術不斷發展，Bio-Rad、LIFE Technologies、Fluidigm及RainDance等廠家相繼推出技術較為成熟的數字PCR產品。
5.2.6.2技術特點
數字PCR目前的應用包括：稀有等位基因檢測、基因表達絕對定量、核酸標準品絕對定量、二代測序文庫絕對定量等。
主要優點：靈敏度可達0.001~0.0001%，高特異性，可檢測復雜背景下的靶標序列;可高度耐受PCR反應抑制劑;不必依賴對照品或標準品，可對目標拷貝數直接進行精確的鑒定，分析微小的濃度差異;實驗數據分析便捷，每個微滴的檢測結果以陰性、陽性判讀，數據分析自動化;可統計突變率，通過統計分析可得出靶點的突變率。
局限性：數字PCR儀通量較低，目前通常能檢測的信號為FAM和HEX。一般單個反應2重反應效果最佳;數字PCR優點是靈敏度高，但是對于DNA濃度大的樣本處理就沒有優勢，而且核酸濃度高時，每個微滴里面包含的拷貝數不符合泊松分布;數字PCR雖然不依賴標準曲線，但是每次反應之間存在差異，短期內不能代替qPCR，也不能代替其他金標準而作為首選方法。QX200等數字PCR儀目前僅用于科研用途，數字PCR走向臨床檢驗還需要一段時間。
5.2.7熒光原位雜交(FISH)
5.2.7.1技術原理
熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是通過熒光標記的DNA探針與細胞核內的DNA靶序列雜交，并在熒光顯微鏡下觀察分析其結果的一種分子細胞遺傳學技術。它的基本原理是：如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經變性-退火-復性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應，經熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。
5.2.7.2技術特點
FISH主要可對基因缺失、基因融合、基因擴增進行檢測。
主要優點：可多種熒光標記，顯示DNA片段及基因之間的相對位置與方向，空間定位精確;靈敏、特異性好，可同時分析分裂期和間期的多個細胞，并進行定量;可以檢測隱匿或微小的染色體畸變及復雜核型。
局限性：FISH檢測對操作和判讀技術要求較高，診斷醫師必須經過嚴格的FISH操作和結果判讀培訓，只有經FISH操作經驗豐富的醫師判定的結果才具有可靠性;目前FISH檢測的成本昂貴、通量低。
5.2.8免疫組化(IHC)
5.2.8.1技術原理
免疫組化(Immunohistochemistry，IHC)分析利用抗體和抗原之間的結合的高度特異性，借助于組織化學的方法將抗原抗體結合的部位和強度顯示出來，以其達到對組織或細胞中的相應抗原進行定性、定位或定量的研究。
5.2.8.2技術特點
IHC作為篩查工具優于FISH，具有經濟快捷的優點，尤其適用于大量樣本的檢測分析。影響IHC結果的因素主要包括抗體的選擇、檢測前組織的固定，觀察者解釋方面的差別等。
5.2.9 熒光定量逆轉錄PCR(Q-RT-PCR)
5.2.9.1技術原理
逆轉錄PCR(reverse transcription PCR)或者稱反轉錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。由一條RNA單鏈轉錄為互補DNA(cDNA)稱作“逆轉錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶(逆轉錄酶)來完成。隨后，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個循環倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互補DNA。
5.2.9.2技術特點
熒光定量PCR是檢測拷貝數變化的一種快速且經濟的技術方法，該方法技術可用于RNA表達水平檢測該技術主要優點是檢測快速、通量高、靈敏度好，主要不足是對腫瘤組織提取RNA的質量要求較高，在檢測基因表達量時判讀標準尚未統一。FISH、IHC和Q-RT-PCR三種方法在檢測ALK基因重排時的優缺點分析見表1 。
5.2.3 檢測方法選擇策略
實驗室應優選國際和國內“金標準”的檢測方法，同類方法中優先選擇結果穩定性、重復性好、特異性高的技術，同時也應考慮樣本量，檢測項目的多少等，綜合選擇合適的方法。
由于腫瘤組織的異質性，檢測的組織樣本中混有大量正常組織、石蠟樣本提取的DNA質量和數量有限，就檢測靈敏度而言，目前ARMS-PCR>焦磷酸測序>Sanger測序。
在檢測腫瘤基因突變時，不能一味追求檢測方法的靈敏度，靈敏度高的檢測方法對整個實驗過程中的質控要求更為嚴格，需防止因污染而產生假陽性。
在腫瘤靶基因表達檢測時，由于腫瘤樣本的不可再生性，需謹慎選擇使用的方法，如選用熒光定量PCR要求提取的總RNA量達1μg以上，如果腫瘤組織過小，提取的RNA量可能達不到檢測要求，此時應考慮選用對樣本量要求低的檢測方法。
5.2.4 檢測項目
本指南根據檢測靶分子(DNA或RNA)類型及基因表達調控機制類型的不同，將腫瘤個體化治療檢測項目分為基因突變、基因表達、融合基因、基因甲基化檢測四個類型。所述檢測項目均為目前在腫瘤臨床診療中，經過嚴格的循證醫學實驗，且具有明確的臨床應用價值，詳見附錄1。實驗室在開展腫瘤個體化檢測項目時，應評估所開展的檢測項目的科學性，并遵循實驗室的質量管理相關規定。
5.3 DNA提取方法與質量控制
DNA提取之前的病理質量控制非常重要，它決定了最終檢測結果的可靠性。樣本進行檢測前均先行常規病理檢查和診斷(HE染色)，必須經有經驗的病理醫師確定腫瘤細胞的百分比(腫瘤細胞/整張切片所有細胞，必要時應采取富集腫瘤細胞的方法，如手工刮取或顯微切割法。選取以腫瘤細胞為主的、沒有明顯的壞死、黏液和炎性改變的組織進行檢測。
腫瘤細胞比例尚無統一標準，理想情況下，石蠟樣本中腫瘤細胞的比例不應低于50%，新鮮樣本不低于25%，對于ARMS等敏感性較高的方法，腫瘤細胞的含量和比例可以低一些。具體視所采用的DNA提取方法和突變檢測方法的敏感度等而定。
對于新鮮和凍存的手術組織樣本，可采用常規的商品化DNA提取試劑盒。對于活檢樣本，推薦使用能提取石蠟包埋組織微量DNA的試劑盒。對于商品化核酸提取試劑盒，臨床實驗室在使用前，必須對其核酸提取純度和效率進行評價。
純化的靶核酸的完整性可使用凝膠電泳將樣本的核酸提取物與核酸標準品比較測定。
核酸提取的產率：可在A260讀數測定，DNA可溶于TE溶液中，建議濃度控制在50~100ng/ul，總量20~40 μg或以上。
核酸純度：可通過提取物A260/A280比率判定，DNA的比值為1.8，RNA的比值為2.0。若DNA比值高于1.8，說明制劑中RNA尚未除盡。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白質將導致比值降低。
5.4 RNA提取方法與質量控制
RNA提取常比較困難，尤其是保存年限較長的腫瘤組織，RNA降解非常嚴重。造成RNA降解的原因有兩個方面：RNA核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，易被水解;生物體內和外部環境中存在大量RNA酶，并且RNA酶不易失活，高溫后仍然能夠正確折疊恢復活性。因此從樣本的儲存、RNA的提取及保存，都需要格外小心，防范RNase對RNA的降解作用。
RNA提取的經典方法是胍鹽提取結合酚-氯仿抽提，石蠟樣本或活檢樣本可使用商品化RNA提取試劑盒純化。細胞或組織的徹底勻漿是RNA提取過程中關鍵的步驟，它能夠防止RNA的損失和降解。勻漿的方法應根據細胞或組織的類型來選擇。
核酸提取的產率：RNA可溶于無RNase的純水中，建議濃度控制在100ng/ul以上，總量達30μg以上。
純化后的RNA應測定OD260/OD280比值，RNA：1.7<od260 od280<2.0(<1.7時表明有蛋白質或酚污染;="">2.0時表明可能有異硫氰酸殘存)，進行瓊脂糖凝膠電泳觀察有無DNA污染和RNA的完整程度。
5.5 試劑的選擇、儲存及使用注意事項
臨床檢測試劑必須為CFDA批準的試劑，或具有嚴格標準操作規程(SOP)的自配試劑(LDT)。
所采用的測定方法特異性好，靈敏度、準確度、精密度符合國家衛生計生委臨床檢驗中心、IFCC、WHO等推薦的方法性能。所用標準品或標準參考物符合國家衛生計生委臨床檢驗中心推薦的標準和要求。
5.6 核酸擴增質量控制
臨床PCR檢測方法不但要求特異性好、靈敏度高、還要求具有高的可重復性、準確性，盡量降低假陽性、假陰性和非特異性擴增。臨床樣本擴增時，經常出現假陽性和假陰性，導致檢測結果得出錯誤結論，有時可造成嚴重后果。
在核酸提取中，應至少帶有1份已知弱陽性質控樣本。其最后的檢測結果，應是核酸提取和擴增檢測有效性的綜合反映。同時，還應至少帶一份已知陰性質控樣本，擴增測定的結果可以判斷核酸提取過程中是否發生污染。
如靶核酸為DNA，為判斷DNA擴增的有效性，可使用1份已制備好的弱陽性靶DNA樣本，直接與靶核酸同時擴增檢測。如靶核酸為RNA，則除了可用上述弱陽性cDNA判斷DNA擴增有效性外，還可用已制備好的弱陽性RNA質控來判斷反轉錄的有效性。另外，須設立陰性對照樣品。陰性對照樣品檢測為陰性時，表明試驗全部過程的試劑沒有受到核酸污染。在陰性對照樣品和陽性對照樣品檢測結果成立的前提下，才能對檢測樣品擴增結果進行判定。
5.7 設備維護和校準
實驗室儀器的保養與維護是實驗室實驗技術員的重要組成部分，儀器的保養與維護關系到儀器的適用率、數據的準確率。
儀器設備安裝及技術性能驗收需由項目負責人、儀器設備使用人、實驗室技術人員共同完成，驗收內容按采購合同中技術需求部分以服務協議書的要求逐項進行，并且建立儀器設備檔案。
儀器設備應定期開展校準計量，未經計量檢定、計量檢定不合格或未驗收的對測試有重要影響的儀器設備不得投入使用。
實驗室日常工作中，應重視儀器設備的清潔及維護，做到日維護、周維護、月維護，并及時記錄。
5.8 人員培訓
檢測人員應該有相關的教育背景、相應的工作經驗，接受過專業培訓。培訓主要有內部和外部培訓，內部培訓包括所使用的試劑方法原理、儀器設備操作維護及校準、質量控制等，外部培訓包括國家衛生計生委臨床檢驗中心和國家衛生計生委個體化醫學檢測培訓基地等機構組織開展的各種技術培訓。
5.9 方法的性能驗證
方法學引進初期需對檢測系統測定項目各參數的實驗或評估性驗證，包括精密度、準確度、線性范圍、臨床可報告范圍、特異性、檢測下限、抗干擾能力等。
所有項目的方法驗證應形成詳細的資料備存，資料需詳細描述方法驗證的目的、過程、檢測結果、分析判斷及驗證結論。驗證的結果及結論須經實驗室負責人簽字后才能用于臨床檢測。根據項目的特性，一些方法驗證指標不需進行或未進行時，需在報告中書面解釋原因。推薦用打印的文稿并在專用文件夾保存。
具體的性能驗證方法，如使用的是經CFDA批準的試劑，可參照試劑盒說明書上相應的性能指標部分進行驗證，看是否能在其實驗室內復現說明書所顯示的上述性能指標。如為自制試劑或自建方法，則參考LDT技術指南進行性能評價，建立上述性能指標。以下方法可供參考。
【準確度】
1)參加國家衛生計生委臨檢中心組織的室間質評，從室間質評統計結果評價實驗室檢測結果的偏倚或符合情況，從而評價和驗證實驗室檢測結果的準確性。
2)方法比較實驗：當引進新方法與原有方法進行比較時，最少樣本數為20例，用兩種方法同時測定同樣的樣品。如結果有不符合時，應采用第三種方法或試劑進行確認。
3)檢測已知值的標準物質，對于樣本來源存在問題的檢測方法，可以對已知值的樣本稀釋成不同濃度再檢測，以評估其準確度。
【靈敏度】
1)分析靈敏度：就是確定檢測方法的檢測下限：將一份已知定值的標準品，用野生型的基因組稀釋突變型基因組，設定不同的突變含量，一直稀釋到檢測下限以下為止，平行檢測3管，3管全部檢出且其線性∣r∣≥0.98的最低稀釋濃度即為該方法的檢測下限。(可根據實際情況在最低稀釋濃度附近進行10倍以下的稀釋)
2)臨床靈敏度：主要是驗證方法的假陰性率。從三甲醫院或專業權威檢測機構收集20~50例樣本，進行檢測分析，其靈敏度應滿足臨床檢測要求，靈敏度=[TB/(TB+FN)]×100(TB=true positive、FN=false negative);有CFDA批文的檢測試劑，收集20例陽性樣本進行驗證;沒有CFDA批文的檢測試劑或自己實驗室研發的LDT試劑，收集50例陽性樣本進行驗證，并應進行室間比對。
【特異性】
1)特異性的驗證主要是確認該方法的假陽性率，特異性=[TN/(TN+FP)]×100(TN=true negative、FN=false positive)。
2)從三甲醫院或專業權威檢測機構收集20~50例陰性樣本，進行檢測分析，其特異性應滿足臨床檢測要求。有CFDA批文的檢測試劑，收集20例陰性樣本進行驗證;沒有CFDA批文的檢測項目或自己研發的項目，收集50例陰性樣本進行驗證。
6. 分析后質量保證
6.1 檢測結果的記錄
1)檢測結果的報告應準確、清晰、明確、客觀和及時，杜絕虛假報告。
2)儀器原始數據要仔細分析，根據質控品判斷PCR擴增的有效性，只有當質控品的擴增結果符合項目SOP有關條件時，才可發出報告，否則應重新測定。
3)患者檔案及測定結果一并錄入“檢驗管理系統”。報告內容至少應包括：實驗室名稱、患者姓名、性別、年齡、測定項目、檢測方法、檢測結果、參考范圍、用藥建議及樣本號、樣本類型、檢測日期、實驗操作者、審核者、報告日期、實驗室聯系方式等。否則視為無效或虛假報告單。
6.2 失控結果的記錄與分析
如發現質控數據違背了控制規則，操作員應填寫失控記錄或失控報告單，上交實驗室主管，由專業主管做出是否發出與失控質控品同批患者樣本檢測報告的決定。失控信號一旦出現就意味著與失控質控品同批患者樣本報告可能作廢。此時，首先要盡量查明引起失控的原因，如為假失控，可由實驗室指定的資深人員決定、簽字后發出報告。如為真失控，最好是糾正原因后，全部樣本重新檢測，質控品測定合格后再簽字發出。
6.3 報告及解釋
1)報告的編寫需要有嚴謹有效的流程，以確保檢驗信息的完整、有效、及時、正確，并保護患者的隱私。檢測結果以檢測報告單的形式發放，需提供紙質版檢測報告，有條件的檢測實驗室可以電子版的形式發放報告，并建立網絡查詢系統，送檢醫生通過登陸網站進行檢測結果的查詢。
2)檢驗報告單的應具有患者基本信息、樣本情況(采集、送檢及檢測時間、樣本性質及狀態等)、檢測項目、檢測方法、結果、結果的意義、用藥建議、檢測可能的局限性、檢測單位聯系方式、檢測人員與報告審核人員簽字，審核者應當是主管技師以上的工作人員、本專業實驗室負責人、中級及以上的病理醫師，審核者對檢驗報告的質量負責。
3)結果解釋的責任屬于臨床實驗室，應根據所檢測的人群解釋結果。臨床解釋的責任屬于臨床醫生，其應根據檢測結果和臨床信息向患者解釋檢測結果。綜合臨床分子診斷的實驗數據和臨床信息，為醫師和患者描述此結果對疾病診斷的含義，為個體化用藥提出建議。
6.4 記錄保留
患者和樣本信息：接收樣本后，在“樣本接收記錄本”中記錄患者和樣本信息，對不符合檢測要求的樣本在“樣本拒收登記本”上記錄，并及時通知患者。《樣本檢測申請單》最后保存于擴增區，至少1年以上;其它實驗記錄保存于各自實驗操作區內，至少保存1年以上。《檢測過程實驗記錄》保存于擴增區的專用文件柜內，以備查找。擴增過程中由熒光擴增儀產生的數據文件必須保存在非系統分區的專門文件夾中，定期做備份。
6.5 檢測后基因咨詢
實驗室建立科學的、系統的檢驗結果解釋方案，提供結果的解釋意見。報告單上提供咨詢服務的方式和途徑，如客戶服務專線，配置專業的咨詢服務人員;方便臨床醫生和患者隨時反饋意見和提出咨詢。
6.6 樣本(及核酸)保留與處理
腫瘤個體化治療基因檢測報告發出后的樣本應盡可能較長期保存。實驗室應制定樣本儲存制度對樣本進行保存，建立樣本儲存的規章制度，做好樣本的標識并按規定存放，保存好樣本的原始標碼，建立配套的樣本存放信息管理系統。
樣本的處理和相關材料的處理要符合《醫療廢物管理條例》、《醫療衛生機構醫療廢物管理辦法》及國家、地區的相關要求。
6.7 檢測與臨床數據收集與分析
檢測結果收集、整理分析和數據的管理也是保障臨床基因檢測質量的關鍵環節。臨床的檢測結果應定期統計分析，如基因突變的陽性率，如果發現陽性率高于資料報道值，應引起重視，考慮是否存在假陽性情況，如果陽性率偏低，應結合檢測方法的局限性考慮假陰性的可能，并進行針對性的改進。
7. 腫瘤個體化治療檢測的質量保證
7.1 標準操作程序
原則上按照《個體化醫學檢測質量保證指南》的要求進行。腫瘤個體化治療的檢測SOP，應包括試劑準備、樣本采集、樣本接收與預處理、核酸提取、檢測方法、結果分析和報告、儀器操作、實驗室安全措施等臨床檢驗的所有環節。SOP的編寫應注意通俗易懂、注重細節、清晰明了、圖文并茂。實驗室工作人員應嚴格遵循SOP中的步驟要求進行操作，應每年定期根據實驗室的運行狀況進行SOP審核修訂，對于文件的修訂、廢止、改版或更新，要按照規定的要求，合理且規范進行，并防止無效或作廢版本文件使用。
7.2 質控品
檢測質控品的建立是為了提高實驗室檢測結果的可靠性和可重復性，一般情況下，針對發現罕見的基因突變、實驗運行異常、新批次的試劑與上一批次試劑的比對、儲存條件或反應溫度發生改變后的樣本和試劑、驗證整體測試可靠性的樣本等，都應合理設置質控品。
7.2.1質控品類型
陽性對照：以含有目的片段的DNA(或質粒)作為模板進行擴增，證明PCR試劑是否有效、擴增過程是否正確。但陽性樣品擴增效率高，應嚴格控制其濃度和存放位置，避免其成為潛在的污染源。例如，檢測基因突變時，應根據選用的檢測方法，選擇該方法最低檢測限的陽性樣本。
陰性對照：以不含有目的片段的陰性樣品作為模板進行擴增，用于證明擴增過程中無假陽性現象。
空白對照：以純水作為模板進行擴增，用于證明擴增過程中無假陽性現象。
PCR抑制物對照：在與陽性對照相同的反應體系中，加入相同數量的待測樣品DNA，如果未擴增出目的片段，證明此待測樣品DNA中存在PCR抑制物。
空白提取對照：空白提取對照擴增結果為陽性，說明DNA提取試劑或過程中可能受到污染。
陽性提取對照：陽性提取對照擴增結果為陰性，說明提取過程可能有誤。如果DNA陽性對照擴增結果為陰性，或者DNA陰性對照和空白對照擴增結果為陽性，則說明PCR試劑或擴增過程存在問題。
基因檢測單核苷酸多態性(SNP)時，需要設置多個陽性對照用于檢測野生型純合子基因型、雜合子基因型，突變純合子基因型。質控應盡可能模擬臨床樣本，如基質或采樣方法與待測樣本相同。
7.3 室內質量控制
原則上按照《個體化醫學檢測質量保證指南》的要求進行。建議按照以下原則設定室內質量控制：
(1)如果只檢測1個基因突變，定性測定有一份接近CUT-OFF(2~4倍)的弱陽性和一份陰性質控樣本即可。質控品的設置數量隨檢測樣本數的增加而按比例適當增加，例如臨床樣本數量達到50~60份，則可將陽性和陰性質控樣本的數量翻倍。質控品應隨機放置在臨床樣本中間隨同臨床樣本一起同時處理。
(2)當同時檢測多個突變基因時，可以根據實驗室自身的條件，可只設立能最靈敏地反映檢測問題的2個或3個突變基因的陰陽性質控，下次檢測改用跟上次不同的基因突變的陰陽性對照，依次類推，循環往復。另外，質控樣本在擴增儀中的位置不應持續性的固定在同一個孔，而應在每次擴增檢測時，進行相應的順延，盡可能在一定時間內可以監測到每一孔的擴增有效性。
如果每次質控品的檢測結果均成立，說明結果可信，報告可以發出;反之，就要對這種情況出現的原因進行分析。在找不到合理的解釋的情況下，須將不符合的基因突變和其相應的對照重新檢測。
此外，臨床樣本中每次檢測陽性和陰性結果的出現頻率，以及同一基因型或基因突變出現頻率或連續出現頻率等，均可作為提示實驗室“污染”的質控指標。
7.4 室間質量評價
臨床檢測實驗室應參加室間質評(EQA)，詳細、如實地記錄參與EQA的全過程，根據反饋結果了解本實驗室的能力、自查存在的問題，及時尋求改進方法，解決問題，完善實驗室質量控制體系。
7.5 PCR污染控制
由于腫瘤基因突變檢測時必須設置陽性質控品，陽性樣本加樣時、PCR擴增的產物可能成為PCR實驗室的主要污染來源，而PCR的敏感性和效率特別高，所以少量的擴增產物污染樣本或反應管即可出現假陽性。尤其是PCR擴增產物和質粒分子很容易造成實驗室的污染，導致假陽性現象發生。通過規范實驗室設計、規范試劑耗材管理、規范實驗室操作和技術處理來控制污染。
常見的PCR污染有樣品間交叉污染、PCR試劑的污染、PCR擴增產物污染、氣溶膠污染和實驗室中克隆質粒的污染。
污染控制：規范實驗室設計、規范試劑耗材管理、規范實驗室操作和技術處理，如PCR擴增實驗中使用dUTP，而不用dTTP。
附錄A：常見的檢測項目
A.1 基因突變檢測項目
A.1.1 EGFR基因突變檢測
【基因簡介】 EGFR是原癌基因c-erbB1的表達產物，是表皮生長因子受體(HER)家族成員之一。HER家族由EGFR/HER1/erbB1、HER2/neu/erbB2、HER3/erbB3及HER4/erbB4四個分子構成，在細胞的生長、增殖和分化等生理過程中發揮重要的調節作用。
【常見突變】 EGFR的突變主要發生在胞內酪氨酸激酶(TK)區域的前四個外顯子上(18~21)，目前發現的TK區域突變有30多種。缺失突變主要發生在外顯子19上，最常見的是del E746-A750，替代突變最常見的是發生在外顯子21上的L858R，復制或插入突變發生在外顯子20上。發生在外顯子20上的替代突變T790M為耐藥突變，研究還發現L858Q、D761Y、T854A等耐藥突變。
【EGFR基因突變和EGFR-TKI敏感性】 EGFR-KTI的有效性也因突變類型而不同，外顯子19缺失突變的有效率為81%，L858R的有效率為71%，G719X的有效率為56%。吉非替尼初期有效的全部患者，在后期均產生耐藥。其中50%患者是在19外顯子缺失或L858R點突變等的敏感突變的基礎上，又發生了第790位密碼子蘇氨酸向蛋氨酸的突變(T790M)。研究發現有約1～3%的患者在TKI治療前即存在T790M，即原發耐藥，這種情況下TKI治療難以有效。
【檢測樣本類型】 經10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋的非小細胞肺癌腫瘤組織。
【檢測方法】推薦ARMS或Sanger測序法進行EGFR突變檢測，可考慮采用新一代測序技術同時進行肺癌驅動基因的檢測。
【臨床意義】 (1)預測藥物療效：EGFR是HER/ErbB家族信號通路的首要分子，吉非替尼、厄洛替尼等小分子TKI進入細胞內，直接作用于EGFR胞內的激酶區，干擾ATP合成，抑制酪氨酸激酶的活性，阻斷激酶的自身磷酸化及底物的磷酸化，徹底阻斷異常的酪氨酸激酶信號傳導，從而阻止配體介導的受體及下游信號通路的激活，阻滯細胞在G1期，促進凋亡，抑制新生血管形成、侵襲和轉移，達到治療的作用。小分子TKI的療效與EGFR基因突變密切相關，是TKI療效預測因子。
(2)預后評價：根據是否使用EGFR-TKI對肺癌切除后患者進行預后分析，EGFR敏感性突變并服用TKI的患者至少在單因素分析中有預后良好的趨勢。但是，EGFR基因突變與女性、非吸煙者等這些傳統的預后良好因子有交叉，只分析基因突變進行預后評價幾乎是不可能的。
【用藥建議】(1)吉非替尼、厄洛替尼等小分子酪氨酸激酶抑制劑的療效與EGFR基因發突變密切相關，特別是當第19外顯子缺失、第21外顯子突變(L858R)和第18外顯子突變(G719X)的患者，使用吉非替尼、厄洛替尼等小分子TKI可獲益。
(2)約1~3%未經TKI治療的NSCLC患者第20外顯子存在T790M突變，但經TKI治療后超過50%后耐藥的患者出現T790M突變陽性，導致TKI治療失敗。也有報道認為L747S、D76IY、T854A突變陽性時，患者也會對吉非替尼、厄洛替尼等小分子酪氨酸激酶抑制劑耐藥。
【局限性】臨床實踐表明，并不是所有攜有EGFR突變的NSCLC患者都對酪氨酸激酶抑制劑有效，EGFR-TKI的有效性因突變類型而不同，如對外顯子19缺失突變的腫瘤患者有效率為81%， L858R的有效率為71%，G719X的有效率為56%，而有些患者發生第20外顯子插入突變卻對TKI無效。另外，約10%的EGFR野生型NSCLC患者對酪氨酸激酶抑制劑有效，但其機制尚不明確。
A.1.2 KRAS基因突變檢測
【基因簡介】 哺乳動物基因組中普遍存在三種RAS癌基因家族成員：H-RAS、K-RAS、N-RAS，這三種基因編碼的蛋白質大約有90%的氨基酸同源序列，分子量均為21kDa，故稱為RASp21蛋白，其在功能上與G蛋白相似，可與二磷酸尿苷(GDP)結合為非活性狀態，與三磷酸尿苷(GTP)結合為活性狀態，RASp21 蛋白自身具有弱GTPase活性，位于細胞膜內側參與跨膜信號傳遞作用。KRAS基因是RAS基因家族中三種癌基因的一種，位于12號染色體上，含有4個編碼外顯子和1個5’端非編碼外顯子，共同編碼含189個氨基酸的RAS蛋白。KRAS是表皮生長因子受體功能信號的下游分子，屬膜結合型GTP/GDP結合蛋白，通過GTP和GDP的相互轉化作用有節制的調節KRAS基因對信號系統的開啟和關閉，傳遞細胞生長分化信號。
【KRAS基因的常見突變】KRAS基因突變發生在腫瘤惡變的早中期，并且原發灶和轉移灶的KRAS基因狀態基本保持一致。目前研究發現，KRAS基因在膀胱、乳腺、直腸、腎、肝、肺、卵巢、胰腺、胃，還有造血系統等均在一定頻率的突變，其中以結直腸癌、胰腺癌和肺癌的發生率比較高，在胰腺癌組織高達90%以上，在肺癌中則以肺腺癌為主，突變率為20～30%，結直腸癌患者突變率為27～43%。當KRAS基因催化活性區突變時，該基因永久活化，不能產生正常的RAS蛋白，導致RAS蛋白不依賴EGFR受體激活而持續活化，造成RAS信號通路的異常活化，影響細胞的生長、增殖和分化，促進細胞的惡性轉化，導致細胞增殖失控而癌變。
KRAS基因最常見的突變方式為點突變，90%的KRAS基因突變位于2號外顯子的第12和13密碼子位點，另有1～4%為第61和146密碼子突變。其中結直腸癌中第12密碼子(約82%)是最常見的突變位點。一般中國人群樣本檢測數據G12A高于G12S/C，西方人群相反。
【檢測樣本類型】 經10%中性福爾馬林固定石蠟包埋的結腸癌/肺癌腫瘤組織，或者與原發灶具有同樣病理形態的轉移組織。
【檢測方法】可以采用Sanger測序法，也可采用靈敏度高的ARMS-PCR等。
【臨床意義】 西妥昔單抗和帕尼單抗均通過直接抑制EGFR從而發揮抗腫瘤的作用，在結直腸癌和頭頸部癌的靶向治療中都有肯定的效果。西妥昔單抗治療的有效性受其下游基因KRAS狀態的影響，突變型的KRAS無需接受上游EGFR信號即能夠自動活化該通路并啟動下游信號的轉導。因此只有KRAS基因野生型的患者才能從抗EGFR的治療中獲益，而突變型的患者則不能。
【用藥建議】KRAS野生型患者使用西妥昔單克隆抗體和帕尼單克隆抗體治療效果確切，可顯著提高患者的生存率和改善生活狀態，建議使用;而KRAS的2號外顯子的12號密碼子和(或)13號密碼子或其他密碼子任意突變型患者使用西妥昔單抗和帕尼單克隆抗體抗治療無效，建議不使用該類藥物。而在進行結腸癌靶向藥物治療時，應詢問所有結腸癌患者的家族史，如果懷疑患者有遺傳性非息肉病性結直腸癌(HNPCC)、家族性腺瘤性息肉病(FAP)和輕表型家族性腺瘤性息肉病(AFAP)，除非是進行臨床試驗，否則不應使用貝伐珠單克隆抗體、西妥昔單克隆抗體、帕尼單克隆抗體或伊立替康。
【局限性】臨床實踐表明，只有50%的野生型KRAS患者對抗EGFR治療有效，提示EGFR下游信號通路其他分子的激活和變異可能影響了其治療反應。因此，KRAS基因突變的檢測僅用于預測結直腸癌對抗EGFR靶向藥物的治療效果。
A.1.3 BRAF基因突變檢測
【基因簡介】BRAF基因是1988年由Ikawa等首先在人類尤因肉瘤中發現并克隆確認的一種能轉染NIH3T3細胞且有活性的DNA序列。BRAF基因與ARAF、CRAF基因同屬RAF家族，命名為鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1，位于人染色體7q34，長約190kb，編碼783個氨基酸的蛋白，相對分子質量為84436，有CR1、CR2和CR3三個保守區。BRAF是Ras-Raf-MEK-ERK信號轉導通路重要的轉導因子，具有功能的編碼區由2510對堿基組成，主要通過有絲蛋白激酶通路中的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶來發揮作用，該酶將細胞表面的受體和RAS蛋白通過MEK和ERK與核內的轉錄因子相連接，啟動多種因子參與調控細胞內多種生物學事件，如細胞生長、分化和凋亡。研究表明，在多種人類惡性腫瘤中，如惡性黑色素瘤、結直腸癌、肺癌、甲狀腺癌、肝癌及胰腺癌，均存在不同比例的BRAF突變。
【常見突變】BRAF突變主要有兩種類型：1.11%位于exon11上的甘氨酸環，如G463、G465、G468的點突變;2.89%的突變發生在exon15上的激活區，其中約92%位于第1799核苷酸上，T突變為A(T1799A以前認為是T1796A)，導致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代(V600E以前被認為是V599E)。此外，僅不到1%的癌組織同時存在BRAF突變與RAS突變，且在這1%中，BRAF突變幾乎均為非V600E突變。以上兩種類型的突變均能使BRAF激酶活性及NIH3T3細胞轉化能力提高，但以后者更為重要。V600E突變能模擬T598和S601兩個位點的磷酸化作用，使BRAF蛋白激活。
【BRAF突變與維羅非尼(vemurafenib)】2011年FDA批準維羅非尼用于治療晚期(轉移性)或不可切除的黑色素瘤，尤其是攜有BRAF V600E基因變異腫瘤者。該藥的安全性和療效評估基于一項國際單中心研究。該研究納入675例BRAF V600E變異的初治晚期黑色素瘤患者，入選者被隨機分入維羅非尼組或達卡巴嗪組。結果顯示，在維羅非尼組患者未達到中位生存期終點時(77%的患者生存)，達卡巴嗪組患者中位生存期為8個月(64%的患者生存)。該藥最常見副作用為關節痛、皮疹、脫發、疲乏、惡心和皮膚光敏感。
中國黑色素瘤患者中BREF V600E變異率接近26%，雖然不如白種人(約50%)的變異率高，但仍有可能通過這個藥物治療我國1/4黑色素瘤患者，因此該藥物對于黑色素瘤患者的治療有著十分重要的意義。
【檢測樣本類型】經10%中性福爾馬林固定石蠟包埋的結腸癌腫瘤組織和黑色素瘤組織。
【檢測方法】BRAF基因突變的檢測方法進可以采用Sanger測序法，也可以使用ARMS-PCR等方法進行檢測。
【臨床意義】(1)BRAF是位于KRAS下游級聯信號通路上的一個重要蛋白，當BRAF基因發生突變后，其編碼生成的蛋白產物無需接受上游信號蛋白的活化便始終處于激活狀態，啟動下游細胞信號轉導途徑，引起細胞增殖，從而使EGFR抑制劑西妥昔單克隆抗體和帕尼單克隆抗體等療效減弱或無效。
(2)BRAF基因可作為患者預后評價的獨立性指標，BRAF V600E突變患者呈現預后更差的趨勢。
(3) BREF V600E基因突變的黑色素瘤患者對維羅非尼治療有效。
【用藥建議】(1) 對于KRAS基因野生型但同時具有BRAF基因V600E突變的患者，抗EGFR單克隆抗體靶向藥物治療可能無效。(2)回顧性亞組分析顯示，無論BRAF基因V600E是否存在突變，一線治療采用抗EGFR單克隆抗體聯合有效的化療藥物都有可能使患者獲益。目前有限的研究數據提示，一線治療后病情進展的患者，如果存在BRAF V600E突變，使用抗EGFR單克隆抗體的療效欠佳。
(3)50%以上表達BRAFV600突變的晚期黑色素瘤患者在維羅非尼治療中可獲得臨床應答。
【局限性】(1)BRAF基因突變的檢測用于預測結直腸癌抗EGFR單克隆抗體靶向藥物的治療效果和預后，必要時必須結合NRAS、KRAS、PI3KCA等基因的突變的檢測。(2)研究發現黑色素瘤患者BRAF V600突變位點外，如攜帶BRAF L597和K601突變可能對BRAF抑制劑藥物維羅非尼藥物治療敏感，但目前還需進一步開展研究來證實這些發現。
A.1.4 C-KIT基因突變檢測
【基因簡介】C-KIT基因位于人染色體4q11-21，屬于原癌基因，其cDNA全長共5230bp，含有21個外顯子，編碼一個145KD的跨膜酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor，RTK)蛋白，命名CD117。第1號外顯子編碼起始密碼子和信號肽，第2-9號密碼子編碼膜外配體結構域，第10號外顯子編碼疏水跨膜結構域，第11-20號外顯子編碼膜內結構域。其中11號外顯子編碼近膜區段。C-KIT受體屬于III型RTK家族，分布于細胞表面，可以用CD117單克隆抗體檢測，與血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptors，PDGFR)有很強的同源性。
【常見突變】多數胃腸道間質瘤(GIST)發生源于C-KIT基因突變，C-KIT突變主要發生在近膜區的外顯子11，然后是外膜區的外顯子9，酪氨酸區段的外顯子13、14、17也可以發生突變。最近數據顯示，約8~50%的大腫瘤GIST中可觀察到典型的突變，突變頻率約35%。在不同GIST中，C-KIT基因突變型式并不完全一樣，最常見為第11號外顯子突變，導致其編碼的近膜結構域的空間結構改變，消弱或喪失對激酶結構域的抑制功能。
【C-KIT基因突變與伊馬替尼療效】甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate)(商品名：格列衛)是一種口服的酪氨酸激酶抑制劑類藥物，能夠有效地選擇性抑制所有類型的abl酪氨酸激酶活性，包括v-abl、PDGFR和C-KIT蛋白等。伊馬替尼于2001年5月在美國上市，同年11月在歐洲上市，并于2002年4月在中國上市。最初被應用于費城染色體陽性的(Ph+)慢性粒細胞白血病(CML)的治療，之后被批準用于胃腸道間質瘤的治療，使得GIST治療進入了分子靶向時代。
一般認為C-KIT/PDGFRA突變類型可以預測伊馬替尼的療效，其中C-KIT 外顯子11突變者的療效最佳;PDGFRA D842V 突變可能對伊馬替尼與舒尼替尼原發耐藥。舒尼替尼治療GIST原發C-KIT外顯子9突變者和C-KIT野生型者優于C-KIT外顯子11突變患者;治療繼發性C-KIT外顯子13、14突變患者療效優于繼發C-KIT外顯子17、18突變者。
CSCO胃腸間質瘤專家委員會推薦存在以下情況時，應該進行基因學分析：①所有初次診斷的復發和轉移性GIST，擬行分子靶向治療;②原發可切除GIST手術后，中-高度復發風險，擬行伊馬替尼輔助治療;③對疑難病例應進行C-KIT 或PDGFRA突變分析，以明確GIST的診斷;④鑒別NF1型GIST、完全性或不完全性Carney’s 三聯征、家族性GIST及兒童GIST;⑤鑒別同時性和異時性多原發GIST。
檢測基因突變的位點，至少應包括C-KIT基因的第9、11、13和17號外顯子及PDGFRA基因的第12和18號外顯子。由于大多數GIST(65～85%)的基因突變發生在C-KIT基因的第11號或第9號外顯子，對于經濟承受能力有限的患者，在鑒別診斷時，可以優先檢測這兩個外顯子;但是，對于繼發耐藥的患者，宜增加檢測C-KIT基因的13、14、17和18外顯子。
【檢測樣本類型】 經10%中性福爾馬林固定石蠟包埋的GIST腫瘤組織。推薦檢測的樣本類型為治療前的原發癌腫瘤組織或轉移的腫瘤組織。
【檢測方法】C-KIT基因突變的檢測方法可以采用Sanger測序法、ARMS-PCR等方法檢測特定的突變位點。
【臨床意義】 (1)輔助診斷和預測療效：伊馬替尼是一種酪氨酸蛋白酶抑制劑，能阻斷酪氨酸蛋白激酶KIT受體功能，從而抑制腫瘤的形成。已有研究證實，C-KIT基因突變的位置能影響腫瘤患者對伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑的反應。通過檢測C-KIT基因的突變狀態，協助GIST診斷，也可以進一步的明確診斷CD117陰性的患者，診斷家族性GIST，評價小兒GIST，指導化療，預測化療的效果。(2)預后評價：當C-KIT基因第11外顯子發生突變后，患者預后較發生于C-KIT基因其他外顯子或PDGFRA基因突變的患者或者未檢測到C-KIT基因或PDGFRA基因突變的患者預后更差。來源于小腸或結腸的CIST如發生C-KIT基因第9外顯子突變，較發生C-KIT基因第11外顯子突變者更具有侵襲性。
【用藥建議】伊馬替尼、蘇坦替尼等酪氨酸激酶抑制劑與C-KIT基因發突變密切相關，對發生于外顯子9、11、12和17的原發性突變患者，使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑時，患者可從抗C-TKI靶向藥物治療中獲益。當發生位于第13、14、17、18外顯子的繼發性突變時，則使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑出現耐藥。
【局限性】由于存在腫瘤異質性，或腫瘤組織中混有大量正常組織，或壞死組織過多等，均有可能導致假陰性結果的產生。同時還有部分患者無法提供檢測所需的組織樣本，或組織樣本無法滿足檢測的基本要求，或患者病情發展及治療過程中會發生C-KIT基因狀態的變化，均可導致治療的失敗。此外，C-KIT基因的突變與伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑敏感性之間的關系因人而異。伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑在體內的代謝受CYP450 3A4狀態的影響，因此即使C-KIT基因突變陽性的患者，伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑亦不一定能達到預期臨床療效，需要考慮其他因素的干擾。
A.1.5 PDGFRA基因
【基因簡介】PDGFR是分子量為180kD的單鏈膜糖蛋白，細胞外配體結合區含5個免疫球蛋白樣結構域，具保守的半胱氨酸殘基，單一跨膜片段;胞內的酪氨酸激酶區斷裂處，為親水氨基酸插入序列。受體分子由α，β兩種亞基組成，成熟后的PDGFR以二聚體穩態形式(αα，αβ，ββ)與配體PDGF (platelet-derived growth factor，PDGF)相應異構體(PDGF-AA，AB，BB)結合。結直腸癌組織中PDGFR α和PDGFR β均有表達分布，PDGFR α分布于結直腸正常組織、息肉組織及腫瘤組織上;PDGFR β表達于腫瘤細胞、腫瘤間質細胞和微血管細胞(包括微血管周細胞)上。
【PDGFRA基因的突變】PDGFRA基因突變常見于GIST、膠質母細胞瘤、惡性外周神經鞘等腫瘤，其中GIST中PDGFRA基因突變率在5~10%左右，突變主要發生于PDGFRA基因的近膜端區域(外顯子12)和激酶區(外顯子14和外顯子18)，突變頻率分別為0.8%和3.9%，其中以外顯子18突變為主。PDGFRA常見突變類型見。 PDGFRA基因突變后則通過活化AKT、MAPK及STAT蛋白中STAT1和STAT3發揮作用。也有研究發現活化的A-Raf激酶能調節PLCG1經PDCFR依賴途徑的信號轉導，也能調節PI3K經PDCFR非依賴的信號轉導。
【檢測樣本類型】經10%中性福爾馬林固定石蠟包埋的腫瘤組織。推薦檢測的樣本類型治療前的原發癌腫瘤組織或轉移的腫瘤組織。
【檢測方法】PDGFRA基因突變的檢測方法可以采用Sanger測序法、ARMS-PCR等方法檢測特定的突變位點。
【臨床意義】(1)輔助診斷和預測療效：伊馬替尼是一種酪氨酸蛋白酶抑制劑，能阻斷酪氨酸蛋白激酶KIT受體功能，從而抑制腫瘤的形成。已有研究證實，PDGFRA基因突變的位置能影響腫瘤患者對伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑的反應。研究表明，PDGFRA基因外顯子12和外顯子18大部分基因位點突變后使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑治療時GIST患者可從中獲益。但如外顯子18基因位點發生D842V、RD841-842KI或D1842-843IM突變使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑治療時GIST患者不能從中獲益。(2)預后評價：當PDGFRA基因發生突變后，腫瘤侵襲性較發生于KIT基因突變的患者侵襲性低。
【用藥建議】伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨釀激酶抑制劑與PDGFRA基因發突變密切相關，對發生于外顯子12中的Tyr555Cys和Asp56lVal突變及外顯子18中的Asp846Tyr等突變患者，使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑時，患者可從中獲益。當位于第18外顯子中的D842V、RD841-842KI和DI842-843IM突變時，使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑則出現耐藥。
【局限性】由于存在腫瘤異質性，或腫瘤組織中混有大量正常組織，或壞死組織過多等，無法避免假陰性結果的產生。同時還有部分患者無法提供檢測所需的組織樣本，或組織樣本無法滿足進行檢測的基本要求，或患者病情發展及治療過程中會發生PDGFRA基因狀態的變化，均可導致治療的失敗。此外，PDGFRA基因突變與伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑敏感性之間的關系因人而異。同時伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑在體內的代謝受CYP450 3A4狀態的影響，即使檢測到了PDGFRA基因的突變，使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑不一定能達到預期臨床療效，需要考慮其他因素的干擾。
A.2 基因表達檢測項目
A.2.1 HER2基因表達
【基因簡介】原癌基因HER2位于染色體17q21，習慣上稱為HER2/neu基因或c-erbB-2基因。編碼分子量185kD的跨膜蛋白，因此又被稱為p185 HER2，是具有跨膜酪氨酸激酶活性的生長因子受體。HER2受體介導的信號通路是一個復雜的網絡系統，包括輸入細胞層(配體或生長因子)、信息加工層(受體，SH2蛋白，轉錄因子)和輸出層(細胞生長，分化和轉移)。配體介導受體的二聚體是關鍵，使該信號系統能夠傳遞多種生物信息，而缺乏特異性配體的HER2在整個信號網絡中起調節作用。信號轉導涉及的主要通路包括：Ras、Raf-Mek-MAPK、PBK、Akt激酶、cAMP(蛋白激酶A)、磷脂酶C-r和src等。HER2通過這些信號轉導通路使細胞增殖周期變短，惡性表現增強和抗凋亡。
【HER2基因過表達與乳腺癌等】HER2基因在乳腺癌、膀胱癌、結直腸癌、胃癌和非小細胞肺癌等中均存在表達上調。許多研究資料表明，在20～30%的乳腺癌中存在HER2基因明顯擴增或過表達，臨床上HER2基因過表達的乳腺癌患者往往表現出生存率低、腫瘤惡性程度增強、進展迅速、易于發生淋巴結轉移、化療緩解期縮短，并對他莫昔芬(Tamoxifen)和很多細胞毒性化療藥耐藥等，但對大劑量蒽環類、紫杉類藥物療效好。由于HER2基因位于細胞表面，易被抗體接近，故HER2基因可作為抗腫瘤治療的一個靶點。
【檢測樣本類型】經10%中性福爾馬林固定石蠟包埋的乳腺癌腫瘤組織。治療前的原發腫瘤組織或轉移的腫瘤組織。
【檢測方法】對HER2基因表達的檢測方法可以采用FISH、IHC、擴增顯色原位雜交(CISH)等，目前也有實驗室使用熒光定量PCR等方法進行檢測，但該方法用于檢測HER2基因的表達尚未得到認可。一般來說，實驗室首先采用IHC方法進行HER2蛋白檢測，如果檢測結果為2+，則進行原位雜交(FISH)方法進行HER2基因檢測確認。
【結果判讀】
免疫組織化學(IHC)檢測：
1)3+，HER2表達陽性;
2)1+或陰性，表達陰性;
3)2+時則需要進行FISH檢測。
FISH檢測：
1)HER2與CEP17信號數比值：≥2.0為陽性，有HER-2/neu基因擴增;
2)HER2與CEP17信號數比值：<2.0時，
若HER2拷貝數≥6.0 為陽性，有HER-2/neu基因擴增;
若 HER2拷貝數<4.0 為陰性，無HER-2/neu基因擴增;
若 HER2拷貝數≥4.0，但<6.0時為不確定，不能確定HER-2/neu基因狀態。
3)若眾多信號HER2信號連接成簇時可不計算，即視為基因擴增。
【臨床意義】準確分析HER2基因擴增狀態是乳腺癌患者預后判斷及制訂有效治療方案的先決條件，對乳腺癌的診療具有重要的指導作用。
(1)預后評價：研究顯示，HER2基因的過表達除了與腫瘤的發生發展相關外，還是一個重要的臨床預后指標，主要表現為HER2基因擴增的乳腺癌浸潤性強、無進展生存期(progress free survival、PFS)短、預后差。而且這部分患者就診時的腫瘤負荷更大，淋巴結轉移的幾率更高，激素受體陰性的比例更高、組織學分級更差、腫瘤的增殖指數更高、復發風險更高。但沒有證據顯示HER2基因擴增與導管原位癌( ductal carcinoma in situ，DCIS)的預后相關。
(2)內分泌藥物療效預測：研究顯示，相對于無HER2基因擴增的乳腺癌患者而言，HER2基因擴增的患者應用他莫昔芬治療后的死亡風險明顯增高，因此這類乳腺癌患者可能不適合選擇他莫昔芬作為內分泌治療，而且HER2基因擴增的乳腺癌患者對CMF化療方案的反應性降低，宜采用高劑量的蒽環類藥物方案。
(3)靶向藥物療效預測：大量臨床研究數據提示，使用曲妥珠單克隆抗體等治療乳腺癌時，無論是與常規化療聯合用于乳腺癌患者的輔助治療，還是用于輔助治療后的維持治療，及用于晚期乳癌患者的單藥或聯合治療，都能肯定改善HER2基因擴增或蛋白過表達患者的生存，使乳腺癌患者獲益。
即使在使用曲妥珠單抗治療過程中出現疾病進展而需要進一步治療的乳腺癌患者，繼續使用曲妥珠單抗治療仍然有效。而對于HER2基因低度擴增或不擴增的乳腺癌患者，使用曲妥珠單抗療效不佳。
【用藥建議】曲妥珠單抗及拉帕替尼等酪氨酸激酶抑制劑等乳腺癌靶向藥物治療乳腺癌的療效與HER2基因表達狀態密切相關，當HER2基因擴增時，使用曲曲妥珠單抗和拉帕替尼等酪氨酸激酶抑制劑時，患者可從抗HER2靶向藥物治療中獲益。但如果發生PI3KCA基因突變、PTEN基因失活及HER2基因某些位點發生突變時，則會對曲妥珠單抗和拉帕替尼等酪氨酸激酶抑制劑耐藥。
【局限性】由于方法學本身的局限性，IHC和FISH得出的均有不確定結果，無法對HER2基因狀態做出明確判斷。即使經IHC或FISH判斷為HER2基因過表達的患者也未必一定能從靶向治療中獲益，導致這種現象的原因可能是檢測體系本身所造成的假陽性，也可能是HER2基因的信號通路中還存在其他異常的位點。其次腫瘤異質性的存在導致IHC和FISH均無法避免假陰性結果的產生。還有部分患者無法提供檢測所需的組織樣本，或組織樣本無法滿足進行檢測的基本要求，或患者病情發展及治療過程中會發生HER2基因狀態的變化，而IHC和FISH均無法對患者的HER2基因狀態進行動態、實時的監測。
A.3融合基因檢測項目
A.3.1 EML4-ALK融合基因檢測項目
【基因簡介】ALK，即人類間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)，于1994年首先發現于間變性大細胞淋巴瘤AMS3細胞株中，是由1620個氨基酸組成的跨膜蛋白，屬于胰島素受體家族。EML4是人類棘皮動物微管相關蛋白樣4(echinoderm microtubule-associated protein- like 4，EML4)，屬于棘皮動物微管相關蛋白樣蛋白家族，由N末端堿基區、疏水的棘皮動物微管相關蛋白區(hydrophobic echinoderm microtubule-associated protein-like protein，HELP)及WD重復區三部分構成。該融合基因定位于2號染色體的短臂上(2p21和2p23)，其5’端為EML4的片段，3’端為ALK的片段，由倒置后的EML4基因片段與殘余的ALK片段連接。該融合基因擁有EML4基因中的BASIC區域，疏水的棘皮動物微管相關蛋白區及部分WD重復區(后兩部分在部分亞型中缺失)和ALK基因中的Kinase功能區。EML4-ALK 的信號轉導通路為PI3-K/Akt、STAT3/5、Ras-MEK 和PLC-γ/PIP2等，這些通路與細胞存活、增殖和遷移密切相關。
【EML4-ALK融合與克唑替尼】克唑替尼是一種酪氨酸激酶受體抑制劑，靶向分子包括ALK、肝細胞生長因子受體(HGFR，c-Met)和ROS1，于2011年獲得美國食品和藥品管理局(FDA)批準用于治療間變型淋巴瘤激酶(ALK)基因重排的非小細胞肺癌(NSCLC)。EML4-ALK基因融合可促使ALK基因引起致癌融合蛋白的表達。ALK融合蛋白形成可引起基因表達和信號的激活和失調，進而促使表達這些蛋白的腫瘤細胞增殖和存活。克唑替尼在腫瘤細胞株中對ALK和c-Met在細胞水平檢測的磷酸化具有濃度依賴性抑制作用，對表達EML4-ALK或NPM-ALK融合蛋白或 c-Met的異種移植荷瘤小鼠具有抗腫瘤活性在NSCLC患者中，ALK重排的陽性率大約為3～5%，在腺癌、從未吸煙或少量吸煙的患者中EML4-ALK融合的幾率高。
【檢測樣本類型】經10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋的非小細胞肺癌腫瘤組織。推薦檢測的樣本為治療前的原發癌腫瘤組織或轉移的腫瘤組織
【檢測方法】EMIA-ALK融合基因的檢測方法有FISH、IHC、熒光定量PCR等，推薦的檢測方法為FISH。
【臨床意義】(1)預測藥物療效：EMLA-ALK融合基因陽性的NSCLC患者接受以鉑類為基礎的化療，其有效率、疾病進展時間和總生存期與EGFR突變陽性NSCLC患者相似。相反，EML4-ALK融合基因陽性患者不能從EGFR-TKI的基礎治療中受益，表現為原發耐藥，治療結果與無EGFR基因突變的患者相似。而針對EML4-ALK融合基因陽性的患者，使用克唑替尼等針對ALK基因的小分子抑制劑可以獲得良好的臨床治療效果。因此在使用針對ALK基因的小分子抑制劑前，需進行EML4-ALK融合基因突變的檢測。
【用藥建議】針對ALK基因的小分子抑制劑療效與EML4-ALK融合基因密切相關，當存在EML4-ALK融合基因時，可以考慮使用針對ALK基因的小分子抑制劑治療如克唑替尼，患者可以從中獲益，而不應給予吉非替尼、厄洛替尼等EGFR-TKI類藥物，患者不會從中獲益。
【局限性】由于EML4-ALK融合基因檢測方法FISH、IHC和RT-PCR檢測的靈敏度不足及檢測樣本受正常組織干擾等因素的影響，容易造成檢測結果的假陰性。同時EML4-ALK融合基因各種亞型患者在接受克唑替尼治療時是否存在療效差異尚不明確，也有待進一步研究。因此，使用克唑替尼治療EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC患者時，需要定期監測療效。
A.4 基因甲基化檢測項目
A.4.1 MGMT基因甲基化檢測
【基因簡介】人MGMT基因穩定地存在于所有正常組織細胞內，其編碼的MGMT蛋白以分布在人體肝臟的活性最高，其次為淋巴結和腸道，骨髓細胞中的活性最低。MGMT蛋白在不需要任何輔助因子或其他蛋白質的條件下，可以催化DNA分子中鳥嘌呤O6位上的烷基轉移至MGMT本身第145位的半胱氨酸殘基上，鳥嘌呤損傷修復，DNA的結構和功能得以恢復。同時，這種催化作用是一種不可逆的反應，MGMT作用后由于獲得烷基而失活，因此這種酶又是一種自殺蛋白。正常情況下，細胞內MGMT具有解除烷化劑對細胞的致癌作用和消除烷化類藥物對于細胞毒性殺傷作用的雙重生物學功能，而細胞對DNA鳥嘌呤O6位上烷基化修復能力的大小通常取決于MGMT在細胞內的含量和合成的速率。
【MGMT基因啟動子甲基化】影響機體MGMT含量和活性的因素有很多，環境因素、機體器官狀態和基因狀態等。其中基因調節是影響MGMT蛋白含量和活性的主要因素，MGMT基因啟動子甲基化是MGMT最常見的異常，多發生于MGMT啟動子CpG島，導致該基因轉錄停止，表達減少。許多腫瘤如腦膠質瘤、結直腸癌、肺癌、乳腺癌中存在MGMT基因甲基化并均可觀察到MGMT啟動子異常甲基化，啟動子甲基化與19號染色體長臂丟失或19號染色體長臂與1號染色體短臂雜合丟失有關。如p53基因突變后能導致腫瘤細胞MGMT表達減少，活性降低。許多機體環境因素也影響MGMT蛋白的含量和活性，如乙基亞硝基脲、吸煙等可以使肝細胞中的MGMT蛋白表達量和活性明顯增加。MGMT啟動子發生甲基化的患者才可以從替莫唑胺治療中受益。
【結果解釋】正常人群基因組中MGMT基因啟動子CpG位點為非甲基化狀態，如果檢測到基因組中存在MGMT基因啟動子CpG位點的甲基化，提示MGMT基因編碼MGMT蛋白的功能下降或MGMT活性降低。
【檢測樣本類型】經10%中性福爾馬林固定石蠟包埋的腦膠質瘤腫瘤組織或者病理確證的活檢組織。推薦檢測的樣本類型為治療前的原發癌腫瘤組織。
【檢測方法】MGMT基因啟動子甲基化的檢測方法建議采用MSP (methyl-specific polymerase chain reaction，甲基化特異的PCR)、甲基化特異性焦磷酸測序、HRM等方法。
【臨床意義】(1)療效預測： MGMT啟動子發生甲基化的患者明顯比未發生甲基化的患者使用烷化劑的療效好，其總體生存率和無進展生存率更高。MGMT啟動子區甲基化對膠質瘤一線化療藥物TMZ治療膠質瘤的化療療效具有預測價值，且是獨立的預后較好的指示指標。MGMT啟動子未甲基化者從TMZ常規治療方案中獲益較小，應對這類患者采用更有效的有助于克服耐藥的其他化療方案。(2)預后評價：40%腦膠質瘤患者有MGMT啟動子甲基化，甲基化程度越高，預后越差，其對腫瘤的預后和生存期的預示作用較腫瘤的分級、臨床、年齡等其他特征更有效。
【用藥建議】TMZ等烷化劑療效與MGMT啟動子區域甲基化狀態密切相關，對發生了MGMT啟動子區域甲基化的患者，且發生甲基化比例越高的患者，使用TMZ烷化劑治療時，患者可從中獲益。如未發生MGMT啟動子區域甲基化的患者，使用TMZ烷化劑治療則出現耐藥。
【局限性】由于腦部腫瘤的特殊性，限制了腫瘤組織的來源，同時腫瘤組織的異質性、大量壞死組織或大量正常組織的存在，干擾了檢測結果，導致檢測結果的假陰性。同時，MGMT啟動子區域甲基化程度與TMZ烷化劑的療效之間的關系尚未闡明，MGMT基因表達水平也影響了TMZ烷化劑的療效，且TMZ療效也受其他因素的影響，因此尚不能根據MGMT啟動子甲基化狀態判斷TMZ的療效，僅僅是根據是否存在甲基化對TMZ的療效進行預測。
參考文獻：
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[6] NCCN臨床實踐指南：非小細胞肺癌(2015.V1)
[7] NCCN臨床實踐指南：結直腸癌(2015.V1)
[8] NCCN臨床實踐指南：乳腺癌(2015.V1)
